L-酪氨酸的生產方法

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L-酪氨酸早期的生產主要依靠蛋白質水解法。但是蛋白質水解法存在著材料來源有限、工藝與產品複雜、周期長等缺點,因而已經被淘汰。目前 L-酪氨酸主要由酶法、微生物發酵法、提取法和化學法等四種方法來生產 。

酶法

酶法也稱為微生物轉化法,主要是利用微生物細胞內酪氨酸酚裂解酶(tyrosine phenol-lyase,TPL,EC 4.1.99.2)將苯酚、丙酮酸和氨或者苯酚、L-絲氨酸轉化為 L-酪氨酸。目前研究較多的、具有較高酶活的 TPL 主要來自於微生物草生歐文氏菌(Erwinia herbicola) 、中間檸檬酸菌( Citrobacter intermedius) 、弗氏檸檬酸菌( Citrobacter freundii) 以及嗜熱菌( Symbiobacterium toebii) 等。Genex 公司的 Lee 和 Hsiao於 1986 年最早利用產氣克雷伯氏菌(Klebsiellaaerogenes) 絲氨酸羥甲基轉移酶和 Erwinia herbicola ATCC 21434 酪氨酸酚裂解酶,將以甘氨酸為底物合成 L-絲氨酸的反應和以 L-絲氨酸為底物合成 L-酪氨酸的反應相偶聯。在 500mL 反應體係中加入 0.32%苯酚、0.25 M 甘氨酸、0.5 mM 5-磷酸吡哆醛、0.056Mβ-巰基乙醇、1.7mM 四氫葉酸。在 pH 為 7.0、37℃條件下以 37%甲醛啟動反應,16 h 後可產生 L-酪氨酸 26.3 g /L,甘氨酸轉化率達到61.4%。但該工藝穩定性較差而且甘氨酸對 TPL 活性有很強的抑製作用。考慮反應過程中酶活性和穩定性差等缺點,近年來利用 DNA 改組技術提高TPL 穩定性也受到關注。韓國 KRIBB 的 Eugene 等人通過對 Symbiobacteriumtoebii 中的 TPL 進行隨機突變篩選和交錯延伸 DNA shuffling 得到了催化活性提高三倍,同時半失活溫度提高了 11.2℃的 AS6 突變體。測序結果顯示在催化活性區域其存在 T129I 或者 T451A 突變,而包含 A13V, E83K 和 T407A 在內的三個突變則對提高熱穩定性有極大幫助。而此課題組的 Kim 等人在 E. coliBL21(DE3)中過表達此催化活性和熱穩定提高的 TPL,並製備成催化粗提液。在2.5 L 的流加式反應器係統中通過分批補加 2.2 M 的苯酚、2.4M 的丙酮酸鈉、0.4 mM 5-磷酸吡哆醛和 4 M 的氯化銨並在反應罐上方充滿氮氣以降低底物的氧化作用, 40℃反應 30 h 後可積累 130 g/L 的 L-酪氨酸,苯酚的轉化率最高可達 94%。

微生物發酵法

微生物發酵法通常以甘油、葡萄糖等生物質碳源為原料,通過優良的微生物菌種在合適的條件下發酵來累積 L-酪氨酸。早期研究常通過人工誘變來選育 L-酪氨酸高產菌株,如篩選 L-苯丙氨酸或 L-色氨酸缺陷或抗反饋抑製的菌株等。然而大多數微生物積累芳香氨基酸的能力很低,且其代謝途徑的調控機製十分複雜,傳統的誘變育種方法往往隻能對局部代謝途徑或者關鍵酶作用,難以對全局的 L-酪氨酸代謝流造成很大的影響。近年來隨著代謝工程和各種先進生物技術的迅猛發展,重新合理設計微生物的代謝途徑來更好地實現 L-酪氨酸的發酵生產逐漸成為研究熱點。目前研究較多的 L-酪氨酸代謝工程菌主要有大腸杆菌(Escherichia coli)、穀氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黃色短杆菌(Brevibacterium flavum)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等。其中以大腸杆菌和穀氨酸幫杆菌中 L-酪氨酸的合成途徑和調控機製研究的最多並闡釋的最為清楚。

L-酪氨酸生物合成途徑屬於芳香族氨基酸合成途徑。其合成的前體物 4-磷酸赤蘚糖(Erythrose-4-phosphate, E4P)和磷酸烯醇式丙酮酸(Phosphoenol pyruvate, PEP)在 DAHP 合成酶(DS)的催化下縮合生成 3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP),該反應也是 L-酪氨酸生物合成途徑的第一個限速步驟。在大腸杆菌中 DAHP 合成酶包含 AroG、AroF 和 AroH 三個同工酶,其表達和酶活分別受產物 L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和 L-色氨酸的反饋阻遏和反饋抑製。從 DAHP 到分支酸的 7 步反應對於所有芳香氨基酸是共同途徑。而分支酸是芳香族氨基酸合成途徑的分支點,一個分支途徑用於合成 L-色氨酸,另一部分則在分支酸變位酶(Chorism mutase, CM)和預苯酸脫水酶(Prephenatedehydratase, PD)雙功能酶 TyrA 的作用下生成對羥基苯丙酮酸(4HPP),後者通過與 L-穀氨酸的轉氨作用生成 L-酪氨酸,而 TyrA 的表達和酶活同樣受到產物L-酪氨酸的反饋阻遏和反饋抑製。

提取法

提取法在1820年首先由Braconnot發明,他將甘氨酸和亮氨酸從明膠羊色和肌肉水解液中提取得到,那之後,Bopp等人義逐漸在蛋白質中將酪氨酸和絲氨酸水解出來。最古老的氨基酸生產的工芝,即進白質水解提取法。蛋白質可W進行酶、酸或巧的水解,其產物最終為氨基酸。常用6M鹽酸在110°C水解進行12—24h,去掉多餘的酸後,提取出各種氨基酸的混合物。最後使用溶度差法或離子交換樹脂的方法提取,得到相對純度的氨基酸至20世紀

三四十年代,使用提取法己經可以獲得20多種氨基酸,最著名的氨基酸產業就是味精,發展到今天,雖然氨基酸大部分都可從各種資源中提取,但由於資源成本高、低收率、汙染環境等方麵原因,並不適合繼續大規模生產。提取法生產心酪氨酸,一般是利用天然蛋白資源為原料,將其進行水解、濃縮、結晶、脫色等步驟的處理,分離提取心酪氨酸。但因為提取所得產品中L-酪氨度的含量較低,實際上提取法的收率較低,所以並不適合大規模生產。

化學合成法

雖然19世紀化學合成法就己經開始用來合成氨基酸,但直到本世紀50年代才將化學法合成氨基酸,這種方法是利用有機合成和化學工程結合的技術,生產氨基酸。其最大的優勢是不受氨基酸品種上限製,在製備天然気基酸外,還可生產非天然安基酸,包括一些非常特殊結構的氨基酸,並且可以大規模生產。但化學方法也有缺點,主要問題是工藝較複雜,隻能合成氨基酸的D、L-型外消旋體,隻有經過了光學拆分,才可獲得具有光學活性的氨基酸。至今,多種氨基酸仍用化學合成法生產,特別是在飼料中用量很大的D、L-蛋氨酸,目前的生產方法僅有化學合成法,其產量約為幾十萬噸/年。另外,藥用和食用甘氨酸,其大規模的生產方法也是采用化學合成法。


2018年10月15日 14:31
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